LINFOPOIESE

O desenvolvimento da linhagem linfóide conta com diversos sítios acessórios e complementares. Mas, para efeitos didáticos este texto focará somente as principais fontes ou tecidos linfóides primários, que são: a medula óssea para linfócitos B e o timo para linfócitos T.

A diferenciação na linfopoiese gera diversas linhagens celulares, como os linfócitos T, linfócitos B, células NK e células dendríticas linfóides. Alguns fatores de transcrição são considerados indispensáveis para o desenvolvimento da linhagem linfóide. Dentre eles estão Ikarus, Ayolos e Hélios. Estes, são fatores de transcrição da família de “dedos de zinco” (zink finger family factors) e têm ação com efeitos epigenéticos na linfoipoiese. Suas atividades são efetuadas através da formação de homo e heterodímeros. Eles agem estimulando a expressão genes linfóides específicos, assim como inibindo genes não-linfopoiéticos (Fisher, 2002; Georgopoulos, 2002). Por isto, são considerados genes mestres (master genes) para a linhagem linfóide.

Como discutido anteriormente, a dicotomia CMP-CLP parece ser um efeito dose-dependente da expressão do fator PU.1. Este fator em baixas doses permitiria a expressão de CD127 (Dekoter, Lee et al., 2002), que possui um papel primordial na diferenciação linfóide, induzindo o desenvolvimento de células B e expansão dos precursores T. Um outro componente fundamental para a linfopoiese é a cadeia g compartilhada pelos receptores das citocinas IL-2/4/7/9/15/21 (Di Santo, Colucci et al., 1998). Sua ausência causa severa deficiência na linfopoiese (Leonard, Shores et al., 1995), já que nesta condição não ocorre a transdução de sinais destes receptores.

Análises clonais demonstram que apesar da restrição linfóide dos CLPs, esta população fenotipicamente homogênea, ainda é heterogênea quanto à expressão dos fatores de transcrição envolvidos na determinação para linfócitos T e B. (Miyamoto, Iwasaki et al., 2002; Terskikh, Miyamoto et al., 2003). Os CLPs expressam Pax-5, EBF, l5 e GATA-3, Hes-1 e o receptor NOTCH-1, que foram descritos elementos determinantes para células B e T (Nutt, Eberhard et al., 2001), respectivamente.

Embora a cascata hematopoiética iniciada em LT-HSCs seja direcionada para CMPs e CLPs, alguns autores defendem o fato de que o precursor linfóide mais primitivo é o denominado ELP (early lymphoid progenitor – progenitor linfóide inicial) (figura 5) (Allman, Aster et al., 2002; Igarashi, Gregory et al., 2002; Yokota, Kouro et al., 2003; Busslinger, 2004). Este precursor é identificado pela expressão de RAG-1[1] associada ao perfil B220⁺AA.4⁺CD4^low , tanto na vida fetal quanto na adulta. No entanto, a localização hierárquica de ELP na cascata hematopoiética ainda não é consensual.

Linfopoiese de células dendríticas (DCs) e natural killer (NK)

Ainda existem inconsistências na literatura quanto à identificação dos programas genéticos e progenitores intermediários para as células NK e dendríticas. Por este motivo, serão comentados somente os pontos pacíficos para estas linhagens. As células dendríticas são entidades celulares envolvidas na apresentação de antígenos em diversos cenários do sistema imune. Elas podem ser divididas em dois grandes grupos: CD11c⁺CD8a⁺CD11b^- e CD11c⁺CD8a^-CD11b⁺, sendo consideradas células dendríticas linfóides e mielóides, respectivamente.

Existem evidências de que na medula óssea as células dendríticas se diferenciam a partir de um precursor comum identificado como CD11c⁺B220⁺CD43⁺CD24⁺Gr-1^-F4/80^- (Del Hoyo, Martin et al., 2002). Em tecidos linfóides secundários as DCs podem ser originadas tanto do CMP quanto do CLP (Manz, Traver et al., 2001). No ambiente tímico somente os CLPs foram capazes de gerar células dendríticas. Nenhum fator específico foi encontrado até o momento para a designação dendrítica na cascata hematopoiética. Aparentemente, os fatores PU.1 (Guerriero, Langmuir et al., 2000), RelB e Ikaros estão relacionados com deficiências na diferenciação das células dendríticas (revisado em (Kondo, Scherer et al., 2001)). No entanto estes fatores possuem efeitos variados que atingem também outras linhagens, sendo necessário um aprofundamento neste domínio.

As células NK estão principalmente relacionadas com a resposta imune montada numa infecção viral ou manifestação cancerosa. Elas também podem ser geradas em diversos sítios linfóides e podem ser classificadas em vários subgrupos funcionais, de acordo com o plantel de receptores transmembrana expressos (Colucci, Di Santo et al., 2002). Ensaios clonais de precursores da medula óssea murina adulta, sugerem que a população Lin^-CD3^-CD122⁺Dx-5^-NK1.1^-, concentra os precursores medulares das células NK (Rosmaraki, Douagi et al., 2001). No entanto, ainda não existe nenhuma relação hierárquica com nenhum precursor já mencionado até aqui.

A exemplo de outros modelos, muitos elementos já são conhecidos como essenciais para o desenvolvimento das células NK (Lian e Kumar, 2002; Colucci, Caligiuri et al., 2003). Dentre eles, estão os fatores de transcrição Id2 (Yokota, Mansouri et al., 1999), Id3 (Heemskerk, Blom et al., 1997) e Ets-1 (Barton, Muthusamy et al., 1998). Além deles, as citocinas IL-15, IL-2 e IL-7 possuem um importante papel no comprometimento dos precursores com a linhagem de células NK, já que são multiméricos e dividem a cadeia gama ou g_c (Di Santo, Colucci et al., 1998). Embora importantes avanços tenham sido alcançados, ainda são necessários estudos mais detalhados em relação à hierarquia da cascata hematopoiética tanto para as células dendríticas quanto NKs.

Linfopoiese B

Os linfócitos B compõem uma entidade celular que faz parte da imunidade celular adquirida. Estas células são responsáveis pela produção das imunoglobulinas, que fazem parte da imunidade humoral. A diferenciação destes linfócitos ocorre majoritariamente na medula óssea, no processo da hematopoiese. Atualmente, muito já é conhecido sobre o desenvolvimento das células B (Douagi, Vieira et al., 2002; Busslinger, 2004).

O comprometimento da linhagem B envolve precocemente os fatores E12 e E47, gerados por edição alternativa do fator E2A. O balanço entre a expressão de PU.1, junto com a sinalização de IL-7 e E2A (Kee, Bain et al., 2002), induzem o aparecimento do primeiro elemento específico da linhagem B, o fator EBF (early B cell factor – fator inicial de célula B). E2A e EBF são indispensáveis para a indução do início dos rearranjos das cadeias do BCR[2] (Sigvardsson, O'riordan et al., 1997). Além disso, EBF também promove a transcrição de Pax-5 (Hirokawa, Sato et al., 2003). Este último é considerado o gene que caracteriza a determinação dos linfócitos B, pois sua depleção reverte o comprometimento B e sua expressão forçada promove o desenvolvimento B (Mikkola, Heavey et al., 2002; Souabni, Cobaleda et al., 2002). Estas atividades de Pax-5 incluem a indução da expressão de CD19 (Schebesta, Heavey et al., 2002) e inibição da via de sinalização de NOTCH, que é o análogo de Pax-5 para o comprometimento T (Souabni, Cobaleda et al., 2002). Animais deficientes do fator Pax-5 demonstram um aprisionamento do desenvolvimento de células B no estágio pro-B. Além disso, a ausência condicional de Pax-5 em células B maduras, devolve a capacidade destas células de formar monócitos (Mikkola, Heavey et al., 2002). Estes resultados caracterizam o fator Pax-5 como um elemento essencial para manter o fenótipo de linfócitos B e, portanto, preservar o comprometimento celular.

Nas últimas duas décadas, diversos estágios da cascata de diferenciação das células B foram identificados (figura 5). A classificação mais abrangente foi inicialmente descrita por Richard Hardy (Li, Wasserman et al., 1996) e, recentemente revisada por Meinrad Busslinger (Busslinger, 2004). Resumidamente, na medula óssea adulta a cascata de diferenciação dos linfócitos B é divida em seis frações subseqüentes, denominadas de A a F. A fração A possui um fenótipo AA.4⁺CD117^lowCD127⁺B220⁺CD43⁺CD19^-Flk2⁺BP-1^-CD24^-, também identificada como células pré-pro-B. O segundo estágio, fração B ou célula pro-B inicial, tem o fenótipo CD127⁺B220⁺CD43⁺CD19⁺BP-1^-CD24⁺. A fração C, ou célula pro-B tardia, é identificada fenotipicamente como CD127⁺B220⁺CD43⁺CD19⁺BP-1⁺CD24^high. A partir deste último, já pode ser detectado o rearranjo das cadeias precursoras do receptor de células B ou BCR (B cell receptor). A fração D, ou célula pré-B, é CD127⁺B220⁺CD43^-CD19⁺BP-1⁺CD24⁺; já a fração E, ou célula B imatura, é identificada como CD127⁺B220⁺CD43^-CD19⁺CD24⁺BP-1^-IgM⁺. Finalmente, a fração F, ou células B maduras, é CD127⁺B220^highCD43^-CD19⁺CD24^-BP-1^-IgM⁺IgD⁺. Como discutido anteriormente, existem precursores fetais com correspondentes na medula óssea que possuem bipotencial B/mielóide (Cumano, Paige et al., 1992; Montecino-Rodriguez, Leathers et al., 2001; Douagi, Vieira et al., 2002). No entanto, ainda existe muita contradição a respeito da importância fisiológica destes precursores bipotentes.

O desenvolvimento dos linfócitos B tem peculiaridades no período fetal que começam a ganhar definição. De fato, existe também uma hierarquia indutiva para as células B na ontogenia do organismo. A atividade do receptor Flk2 parece ser responsável por uma atividade indutiva basal (Ray, Paige et al., 1996). Durante a vida fetal e perinatal, a citocina TSLP (thymic stromal-cell derived lymphopoitin – linfopoietina derivada do stroma tímico) é o sinal extrínseco mais importante para a linfopoiese B (Levin, Koelling et al., 1999). Já na vida adulta, IL-7 assume o papel de TSLP (Vosshenrich, Cumano et al., 2003).

 

 

Linfopoiese T

Os linfócitos T são elementos da imunidade adquirida. Eles são caracterizados pela expressão do receptor de células T ou TCR (T-cell receptor) e, por de formarem diversas subpopulações com diferentes funções no seu desempenho fisiológico. A maturação das células T é feita no timo (Petrie, 2003), um órgão hematopoiético acessório apesar de ser considerado classicamente um órgão linfóide primário. Por esta característica acessória, preconiza-se que o precursor hematopoiético T venha da medula óssea, o centro da hematopoiese. A migração do precursor T para timo é considerada um assunto estabelecido na biologia (Petrie, 2003). No entanto, a identidade deste precursor imigrante ainda gera divergências científicas, já que a população CLP não pôde ser identificada no ambiente tímico. Sugerindo que há um intermediário subseqüente aos CLPs, ou que existe uma população progenitora pré-tímica distinta (Allman, Sambandam et al., 2003).

Como mencionado anteriormente, no ambiente fetal, ou da medula óssea, células B220⁺AA.4⁺CD4^low expressando RAG-1, denominados ELPs (early lymphoid progenitors – progenitores linfóides iniciais) (Igarashi, Gregory et al., 2002; Miller, Izon et al., 2002; Yokota, Kouro et al., 2003), são capazes de originar restritamente a linhagem linfóide in vitro e in vivo. A existência dos ELPs é independente dos CLPs, já que animais nocautes para Ikaros não possuem CLP, mas têm ELPs ativas (Miller, Izon et al., 2002; Allman, Sambandam et al., 2003). Entretanto, as ELPs não parecem ser responsáveis pelos precursores tímicos, pois também não são encontradas lá. Por este motivo, sugere-se na literatura que ELPs possam ser pogenitores das células que entrariam no ambiente tímico para o desenvolvimento de linfócitos T (Busslinger, 2004).

Esta busca pelo precursor tímico levou à caracterização de uma população celular da medula óssea, denominada ETP (early T progenitors – progenitores iniciais de linfócitos). Os ETPs, são restritos à linhagem linfóide e podem ser identificados com o fenótipo Lin^-CD117^highSca-1⁺CD90^-CD62^-L⁺CD127^-/low (Allman, Sambandam et al., 2003; Bhandoola, Sambandam et al., 2003). Coincidente com a atividade de comprometimento linfóide, esta população possui expressão citoplasmática de pTa (cadeia acessória do TCR) (Gounari, Aifantis et al., 2002). Contudo, ETPs têm baixa eficiência de migração para o ambiente tímico (Gounari, Aifantis et al., 2002; Allman, Sambandam et al., 2003; Martin, Aifantis et al., 2003).

Paralelamente, foi descrito a existência de uma população da medula óssea denominada CLP-2 (Martin, Aifantis et al., 2003) ou B220⁺CD117^-CD127⁺CD19^-. Estas células possuem um certo grau da promiscuidade genética (descrita em precursores), são restritas à atividade linfopoiética e, além disso, são capazes de gerar uma população fenotipicamente semelhante à população DN1, discutida abaixo.

Portanto, hipoteticamente a cascata linfopoiética T extratímica pode começar com a população ELP, Lin-CD117+CD127lo, que gera tanto ETP, quanto CLP-1, Lin-CD117loCD127+. CLP-1 dá origem a CLP-2, B220+CD117-CD127+ e esta finalmente alcança o ambiente intratímico, transformando-se no precursor mais primitivo detectado no timo, denominado DN1[1] (Martin, Aifantis et al., 2003) (figura 6). No entanto, toda esta relação hierárquica ainda não foi experimentalmente comprovada.

Uma vez que o precursor hematopoiético da medula óssea ganha o espaço intratímico, ele invade o parênquima do órgão pela junção cortico-medular (JCM), através dos vasos sanguíneos (Prockop e Petrie, 2000; Lind, Prockop et al., 2001) (figura 4). O contato com este microambiente, composto pelas células estromais tímicas, gera sinais indutivos para o comprometimento celular T. Dentre estes sinais, está a interação de NOTCH-1, expresso pelos timócitos (precursores), com os seus ligantes Delta-1 e 4 (Schmitt e Zuniga-Pflucker, 2002; Harman, Jenkinson et al., 2003a; Hozumi, Negishi et al., 2004), presentes nas células epiteliais tímicas (TECs). As evidências da participação da família de receptores NOTCH e seus ligantes identificam estas moléculas como as responsáveis pelo comprometimento da linhagem linfóide T.

A deficiência de NOTCH-1 causa formação de células B (Koch, Lacombe et al., 2001) no timo, ao invés de linfócitos T. A expressão forçada de Deltex-1 também causa efeito semelhante (Izon, Aster et al., 2002). Deltex-1 é um fator citoplasmático que inibe a cascata de sinalização à jusante de NOTCH-1. Corroborando com este fato, Pax-5 (fator determinante da linhagem B) foi demonstrado ser um indutor de Deltex-1 (Allman, Aster et al., 2002; Hardy, 2003; Busslinger, 2004). Por outro lado, Hes-1 que é um elemento positivo à jusante na cascata de sinalização de NOTCH, foi demonstrado sofrer aumento de expressão após a estimulação dos componentes citoplasmáticos de NOTCH (Guidos, 2002). Além disso, a expressão ectópica tanto dos ligantes quanto das porções citoplasmáticas de NOTCH gera linfócitos T extratímicos (Guidos, 2002; Harman, Jenkinson et al., 2003b; Hozumi, Abe et al., 2003; Hozumi, Negishi et al., 2004). Reforçando a importância da via de sinalização de NOTCH para o comprometimento T.

Outro elemento importante para o comprometimento da linhagem T é o fator de transcrição da família de proteínas “dedos de zinco”, GATA-3. Animais nocautes de GATA-3 são letais, mas as células embrionárias deficientes deste fator ou sua depleção condicional afetam diretamente a diferenciação dos linfócitos T (Ting, Olson et al., 1996). Ou seja, as células embrionárias derivadas deste modelo nocaute não são capazes de gerar linfócitos T mas desenvolvem células B normalmente.

Dentro do timo existe uma dinâmica característica e bem conhecida dos timócitos em maturação. Historicamente, os precursores tímicos mais primitvos são classificados fenotipicamente pela ausência de CD4 e de CD8, denominados células duplo negativas (DNs) As DNs são subdividas em DN-1 a 4, de acordo com a combinação da expressão de CD44 e CD25 (figura 6).

Recentemente, a classificação das DN1s foi refinada ainda mais pelo grau de comprometimento com a linhagem T (Porritt, Rumfelt et al., 2004) (figura 6). Esta subdivisão está classificada de a a e. Donde DN1a, são CD45⁺CD44⁺CD25^-CD90^-CD127^-CD117⁺CD24^-; DN1b, CD45⁺CD44⁺CD25^-CD90^-CD127^-CD117⁺CD24^low; DN1c, CD45⁺CD44⁺CD25^-CD90⁺CD127^-/lowCD117^lowCD24^high; DN1d, CD45⁺CD44⁺CD25^-CD90⁺CD127^-/lowCD117^-CD24⁺; e finalmente DN1e, CD45⁺CD44⁺CD25^-CD90⁺CD127⁺CD117^-CD24^-. As populações DN1c, d e e (com cinética mais lenta) demonstram eficiência significante em reconstituir todos os estágios da diferenciação dos linfócitos T in vitro (Porritt, Rumfelt et al., 2004). Mas somente DN1a e b são capazes de reconstituir a linfopoiese tímica in vivo, após transplante singenéico. No entanto, este fato não significa que estas subpopulações DN1s representam os precursores pré-tímicos, mas sim que DN1a e b podem ser considerados os precursores tímicos canônicos.

A maturação dos timócitos continua ocorrendo enquanto estes seguem em direção à região subcapsular no cótex (Lind, Prockop et al., 2001; Porritt, Gordon et al., 2003) (figura 7). Esta migração intratímica gera modificações fenotípicas nos timócitos, baseadas na expressão de CD44 e CD25, dando origem aos DN2 (CD44+CD25+), DN3 (CD44-CD25+) e DN4(CD44-CD25-) (figura 6). Como mencionado anteriormente, este movimento dentro do timo está associado às quimocinas e aos componentes da matrix extracelular (Petrie, 2002; Prockop, Palencia et al., 2002; Savino, Mendes-Da-Cruz et al., 2002) (figura 4), além da presença de ligantes (ativadores e inibidores) de NOTCH (Anderson, Harman et al., 2000; Petrie, 2000; Anderson, Robey et al., 2001; Anderson e Jenkinson, 2001). Uma vez que os precursores alcançam o córtex, eles retornam em direção à medula do timo. A partir de então, já começam a ser identificados pela dupla expressão de CD4 e 8, denominados timócitos duplo positivos (DPs). Quando ultrapassam a JCM em direção à medula, estes timócitos DPs sofrem induções do microambiente para assumirem um fenótipo simples positivo (SPs), CD4 ou 8. Daí voltam para a JCM e emigram do ambiente tímico (figura 7), como discutido anteriormente.

 

 por Hamilton da Silva Junior

 

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